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铜绿假单胞菌检验方法-化妆品安全技术规范(2022年版)

1.范围

  本规范规定了化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法。

  本规范适用于化妆品中铜绿假单胞菌的检验。

2.定义

  2.1铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa

  属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，大部分能产生绿脓菌素。

3.仪器

  3.1 恒温培养箱:36℃±1℃、42℃±1℃。

  3.2 三角瓶:250mL。

  3.3 试管:18 mm×150mm。

  3.4 灭菌平皿:直径90mm。

  3.5 灭菌刻度吸管:10mL、 1mL。

  3.6 显微镜。

  3.7 载玻片。

  3.8 接种针、接种环。

  3.9 电磁炉。

  3.10 高压灭菌器。

  3.11 恒温水浴箱。

4.培养基和试剂

  4.1 SCDLP液体培养基

  见总则中3.2。

  4.2 十六烷基三甲基溴化铵培养基

  制法:除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4~7.6，加入琼脂，115℃高压灭菌20min后，制成平板备用。

  4.3 乙酰胺培养基

  制法:除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2，加入琼脂、酚红，121℃高压灭菌20min后，制成平板备用。

  4.4 绿脓菌素测定用培养基

  制法:将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加热使其溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115℃高压灭菌20min后，制成斜面备用。

  4.5 明胶培养基

  制法:取各成分加到蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加热使之溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经115℃高压灭菌20min后，直立制成高层备用。

  4.6 硝酸盐蛋白胨水培养基

  制法:将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热使之溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115℃高压灭菌20min后备用。

  4.7 普通琼脂斜面培养基

  制法:除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调pH为7.2~7.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，121℃高压灭菌20min后，制成斜面备用。

5操作步骤

  5.1 增菌培养:取1:10检液10mL加到90mL SCDLP液体培养基中,置36℃±1℃培养18h~24h。如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。

  5.2 分离培养:将增菌后的培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h~24h。凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。

  在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离,将增菌后的培养物划线接种于平板上，置36℃±1℃培养24h±2h，铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基呈红色，其他菌不生长。

  5.3 染色镜检:挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色（见耐热大肠菌群检验方法4.5.2)，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。

  5.4 氧化酶试验:取一小块洁净的白色滤纸片置于灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在15s~30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性;若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。

  5.5 绿脓菌素试验:取可疑菌落2个~3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置36℃±1℃培养24h±2h，加入三氯甲烷3mL~5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于三氯甲烷液内，待三氯甲烷提取液呈蓝色时，用吸管将三氯甲烷移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。

  5.6 硝酸盐还原产气试验:挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置36℃±1℃培养 24h±2h，观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。

  5.7 明胶液化试验:挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置36℃±1℃培养24h±2h，取出放置于4℃±2℃冰箱10min~30min，如仍呈溶液状或表面液化时即为明胶液化试验阳性;如凝固不溶者为阴性。

  5.8 42℃生长试验:挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置于42℃±1℃培养箱中，培养24h~48h，铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。

6.检验结果报告

  被检样品经增菌分离培养后，平板上有可疑菌落，并经证实为革兰氏阴性杆菌、氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌;如绿脓菌素试验阴性而明胶液化、硝酸盐还原产气和 42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。