生活饮用水中微生物的检测方法

检测依据：

GBT5750.2-2006生活饮用水标准检验方法水样的采集和保存

GBT5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标

本文主要包含：

1.生活饮用水中的微生物指标

2.水样采集规则及注意事项

3.菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌的测定方法

4.对所检测水样的综合分析

   生活饮用水中的微生物指标

菌落总数

     水样在营养琼脂上有氧环境下，37℃培养48h后，所得1ml水样所含菌落的总数。

     检测意义:作为一般性污染的指标,即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。水样菌落总数越多,说明水被微生物污染程度越严重,病原微生物存在的可能性越大,但不能说明污染的来源。  

总大肠菌群

     指一群在37℃培养24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

     检测意义:作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群的含量,表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。

耐热大肠菌群

     指一群在44-44.5℃培养24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。我国习惯上称之为“粪大肠菌群”。

  微生物指标常规检验流程图

一、水样采集

采样原则：所采集的样品具有代表性。

采样容器:不能是新的污染源:不吸收或吸附某些待测组分不与待测组分发生反应。保证从采样到分析期间样品各组分的浓度不发生改变。

微生物样品必须按一般无菌操作的基本要求采集,并保证在运送、贮存过程中不受污染。

                            无菌水样采集袋  

自来水水样:先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌再开放水龙头使水流5min(经常用水的水龙头放水1~3min)后,采集水样于无菌玻璃瓶,约占瓶容量80%,以便摇匀水样。

水源水水样:选有代表性的地点及可疑地方,一般距水面下10-15cm采集，采样后在水中改好盖子，再从水中取出。

注意事项

     1.严格无菌操作。

     2.做好标记:采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等内容。

     3.从速送检。水样从采集到检验不应超过2h,在4℃下保存不应超过24h。

二、菌落总数测定

    所需培养基和试剂：营养琼脂、9ml无菌生理盐水管

自来水水样检测

操作步骤：

    1.以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样,注入灭菌平皿中。

    2.倾注约15mL已融化井冷却到45℃左右的营养琼脂培养基,并立即旋摇平皿,使水与培养基充分混匀（每次检验时应做一平行接种,同时另用一个平只倾注营养琼脂养基作为空白对照）

    3.待冷却凝固后,翻转平皿,使底面向上,置于36℃±1℃培养箱内培养48h,进行菌落计数,即为水样1mL中的菌落总数。

    4.培养完成后，用眼睛直接观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。

结果分析与报告:

    计算平均菌落数，若菌落总数(cfu/ml)当检样的菌落数为1~100时,按实有数报告；大于100时,采用二位有效数字报告。

    国家标准(GB5749-2006)规定生活饮用水菌落总数每毫升不得超过100个。  

水源水检测

操作步骤：

   1.以无操作方法吸取1mL充分混匀的水,注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中,混匀成1:10稀释液。

   2.吸取1:10的稀释液1ml，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中,混匀成1:100稀师液,按同法依次稀释成1:1000,1:1000释液等备用（如此递增稀释一次,必须更换一支1m灭菌管）。

   3.然后用无菌极管取稀释的水样和2个~3个适释度的水样1mL,分别注入灭菌平皿内。之后操作同自来水水样的检验步骤。

结果分析与报告:

    计算平均菌落数，首先选择平均菌落在30~300之间者进行计算。  

计算方法和报告方式：

一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系：

注意事项

    1.菌落总数测定中,应选择合适的稀释度进行(生活饮用水,国家标准规定每毫升不得超过100个,因此以直接吸取1毫升到平板进行培养)

    2.各稀释管、相应半皿做好标记。包括:水样名称、稀释度、时间、小组。

    3.严格无菌操作进行水样稀释时,每一稀释度均需更换吸管。

    4.倾注时,要注意营养琼脂的温度。

    5.倾入琼脂后要混匀,待琼脂凝固后倒置培养。

三、总大肠菌群测定

      所需培养基和试剂：乳糖蛋白胨培养液、双料乳糖蛋白胨培养液、伊红美蓝培养基

多管发酵法步骤:

    初步发酵试验:采用乳糖蛋白培养液36℃±1℃培养24h观察产酸产气情况。

    平板分离:对阳性管培养物,接种于伊红美蓝培养基观察菌落特征,并进行革兰氏染色和镜检。

    复发酵证实试验:对典型和可疑菌落,接种于乳糖蛋白胨培养液,进行复发酵证实试验。

    结果报告(MPN):根据GB5750.12-2006所附检索表报告结果。                                                                                 

               初发酵、复发酵试验结果                

大肠菌群在EMB平板上的典型特征 

      大肠菌群革兰氏染色镜检结果 

四、耐热大肠菌群测定

    所需培养基和试剂：乳糖蛋白胨培养液、EC肉汤、伊红美蓝培养基

多管发酵法步骤:

    初步发酵试验:采用乳糖蛋白培养液36℃±1℃培养24h观察产酸产气情况。

    耐热培养:阳性管接种在EC肉汤管中，44.5℃培养24h观察产酸产气情况。

    平板培养:阳性管接种在EMB平板上，36℃±1℃培养24h。

    结果报告(MPN):根据GB5750.12-2006所附检索表报告结果。                                                                                           

        不同细菌在EC肉汤中的生长特征

五、大肠埃希氏菌测定

    所需培养基和试剂：EC-MUG培养基                                            

多管发酵法步骤:

    耐热培养:将总大肠菌群初发酵中产酸或产气的管进行大肠埃希氏菌检测，接种此类试管中的液体到EC-MUG管中，在培养箱或恒温水浴中44.5℃培养24h。如使用恒温水浴，在接种后30min内进行培养，使水浴液面超过EC-MUG管的液面。

    结果报告(MPN):将培养后的EC-MUG管在暗处用366nm紫外灯照射，如有蓝色荧光，则表明水样中含有大肠埃希氏菌。计算EC-MUG阳性管数，根据GB5750.12-2006所附检索表报告结果。  

不同细菌在EC-MUG管中的生长特征

生活饮用水中微生物检测方法总结  

生活饮用水标准检验方法——微生物指标

所需培养基汇总表