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蛋白药物冻干保护剂分类

1前言

冷冻干燥保护剂对于蛋白质的保护原理已经被研究讨论了几十年，形成了一些被普遍接受的共识。如在冻结阶段，最主要的假说为“优先化作用”;在干燥阶段最主要的有2种假说，即“玻璃化”和“水置换”。

冷冻干燥保护剂的分类方式很多，有文献中提出了一个公式化模型，按照功能把冷冻干燥保护剂分类，包括5类: ①pH缓冲剂，如Tris、组氨酸、枸橼酸等;②配体，可以优化蛋白质的热力学稳定性;③稳定剂，一般是双糖，如蔗糖、海藻糖等，可通过抑制蛋白质的展开和提供玻璃基质起保护作用;④非离子表面活性剂，可减少蛋白质的聚集;⑤填充剂，如甘露醇、甘氨酸、羟乙基淀粉、血清白蛋白等，可提高产品的物理成型性。这里我们简要介绍其中几种。

2缓冲盐

首先，蛋白质稳定性受环境pH的影响，缓冲液选择在蛋白质制剂的开发过程中是最关键的，并且必须在配制阶段建立。在选择缓冲液pH时，建议pH不要太接近蛋白质的pI(等电点)以避免聚集。

磷酸盐是蛋白质配方中最常见的缓冲剂之一，特别是含水蛋白质药物，有效pH值范围为5.8-8.0，并且具有生物相容性。然而，正如“冷冻过程中的pH变化”所讨论的那样，磷酸盐缓冲液，特别是磷酸氢二钠，在冷冻过程中会发生显着的pH变化，因此不推荐用于pH敏感蛋白质。相反，磷酸钾，组氨酸，三羟甲基氨基甲烷(Tris)和柠檬酸盐缓冲液在冷冻期间显示出最小的pH变化。此外，低缓冲液浓度可有助于降低pH变化。组氨酸是一种氨基酸，有效pH范围为5.5-7.4，它与生物pH相容，并且经常用于冷冻干燥的蛋白质。然而，选择适当的冷冻干燥水性制剂，包括缓冲剂，取决于蛋白质的要求及其给药途径。因此，需要许多研究和各种生物物理方法来筛选出几种缓冲液的浓度列表。

3填充剂

为了保证冷冻干燥后形成良好的配方结构防止产品塌陷，同时改善配方溶解性，冷冻干燥保护剂中还需要加入填充剂。首先，填充剂在复溶时应该是充分可溶的并且与制剂中的蛋白质药物相容。此外，它们没有毒性问题并且具有高共晶/共熔温度(Teu)，可有效提高冷冻干燥效率。

甘氨酸和甘露醇经常用作冻干蛋白质制剂的填充剂。甘氨酸在用作填充剂时具有优势，因为它是无毒的。它具有高共晶/共熔温度(Teu)，可实现高效冷冻干燥和高溶解度。

甘露醇具有与甘氨酸相同的优点，并且对特定蛋白质药物如LDH和转化生长因子-b1具有稳定作用，其稳定效果取决于其浓度。因此，在选择填充剂时，应仔细考虑稳定效果以及粉饼外观。大多数氨基酸容易结晶并且可以潜在地用作填充剂以稳定蛋白质，然而，酸盐的形成阻碍了它们的结晶。NaCl是另一种结晶剂，但其共熔温度(Teu)相对于其他填充剂的而言太低，因此不推荐使用。

对于填充剂，应考虑退火步骤。甘氨酸和甘露糖醇在冷冻干燥过程中应以结晶形式存在。但是在冷冻步骤期间，过冷却诱导两种填充剂以无定形形态冻结，容易导致粉饼塌陷。另外，在没有退火的情况下，填充剂可以在初级干燥期间重结晶造成西林瓶破裂，特别是当制剂中包含高浓度的甘露醇时。填充剂应在非晶相的玻璃化转变温度(Tg’)和填充剂的共熔温度(Teu)之间进行有效结晶，而退火时间取决于填充剂浓度及其性质。对于甘露醇和甘氨酸，填充高度在1cm时，推荐在-20或-25℃和2小时。

4糖类

糖类是冻干蛋白质制剂中最常用的赋形剂，因为它们的结构中具有许多羟基，因此可以通过取代蛋白质和水之间的氢键来提供稳定效果。此外，大多数糖在正常冷冻干燥条件下不结晶，导致冻干蛋白质制剂更快速复溶。还原性糖通常不用于冷冻干燥，因为它们通过美拉德反应与蛋白质反应，然而，当它们的稳定性效果优于其他赋形剂时，它们可以使用。蔗糖已广泛用于蛋白质制剂配方，海藻糖被认为是比蔗糖更优异的冻干保护剂，因为它具有更高的玻璃化转变温度(Tg’)。海藻糖还具有其他优点，例如低吸湿性，不存在内部氢键，从而与蛋白质的氢键更灵活，化学反应性低。蔗糖和海藻糖的高粘度也可降低在高于玻璃化转变温度(Tg’)的温度下干燥期间的蛋白质变性速率，从而提高冷冻干燥效率。

5其他

多元醇广泛用于蛋白质稳定剂，因为它们可以通过其羟基稳定蛋白质。多元醇已被用作冷冻保护剂和冻干保护剂。例如，在冻融期间，LDH在不同程度上受甘油，木糖醇，山梨糖醇和甘露醇的保护。

聚合物已被用作蛋白质溶液和冻干制剂的保护剂。血清白蛋白是用于蛋白质药物开发的最广泛使用的聚合物之一，作为冻干保护剂和冷冻保护剂。许多上市蛋白质药物含有不同量的白蛋白(表1)。但是，血清白蛋白具有与血源性病原体相关的潜在污染物，限制了其在蛋白质药物制剂中的使用。因此，建议rHA替代血清白蛋白。最终，建议在没有白蛋白的情况下开发蛋白质药物。

在冷冻步骤中，形成冰水界面可能导致蛋白质表面变性。表面活性剂降低蛋白质溶液的表面张力，保护其免受表面变性。最广泛使用的表面活性剂之一是Tween 80。

6小结

已经有超过50%的蛋白质药物产品选择冷冻干燥，因为在固态下，蛋白质药物的物理和化学降解减少，从而保证了其长期稳定性。不同结构和性质的

冷冻干燥保护剂对冷冻干燥的不同阶段保护蛋白质的保护机制不同，联合使用时对某些蛋白质有协同保护作用，所以，了解常用冻保护剂种类和性质对于开发更有效的蛋白制制剂至关重要的。