用一系列被测物标准溶液，按照标准方法规定的步骤，将被测物转变为有色溶液，制备好的标准系列和空白，在方法选定的波长下，测定吸光度。已被测物浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制校准曲线。

步骤：

1、对标准系列，溶液以纯溶剂为参比进行测量后，应先作空白校正，然后绘制标准曲线；

2、标准溶液一般可直接测定，但如试样的预处理较复杂致使污染或损失不可忽略时，应和试样同样处理后再测定；

3、校准曲线的斜率常随环境温度、试剂批号和贮存时间等实验条件的改变而变动。因此，在测定试样的同时，绘制校准曲线最为理想。

否则，应在测定试样的同时，平行测定零浓度和中等浓度标准溶液各两份，取均值相减后与原校准曲线上的相应点核对。其相对差值根据方法精密度不得大于5%～10%，否则，应重新绘制校准曲线。

1、线性检验

即检验校准曲线的精密度，对于以4～6个浓度单位所获得的测量信号值绘制的校准曲线，分光光度法一般要求其相关系数|r|≥0.9990，否则应找出原因并加以纠正，重新绘制合格的校准曲线。

2、截距检验

即检验校准曲线的准确度，在线性检验合格的基础上，对其进行线性回归，得出回归方程y=a+bx，然后，将所得截距a与0作t检验，当取95%置信水平，经检验无显著性差异时，a可做0处理，方程简化为y=bx，移项得x=y/b。在线性范围内，可代替查阅校准曲线，直接将样品测量信号值经空白校正后，计算出试样浓度。

当a与0有显著性差异时，表示校准曲线的回归方程计算结果准确度不高，应找出原因予以校正后，重新绘制校准曲线并经线性检验合格。在计算回归方程，经截距检验合格后投入使用。回归方程如不经上述检验和处理，就直接投入使用，必将给测定结果引入差值相当于解决a的系统误差。

3、斜率检验

即检验分析方法的灵敏度，方法灵敏度是随实验条件的变化而改变的，在完全相同的分析条件下，仅由于操作中的随机误差导致的斜率变化不应超出一定的允许范围，此范围因分析方法的精度不同而异，例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相对差值小于5%，而原子吸收分光光度法则要求其相对差值小于10%等。

被测物转变为有色溶液的反应称为显色反应或发色反应，显色反应介质的pH条件、显色剂用量、显色反应的时间和温度、为消除共存物干扰而加入的掩蔽剂、甚至加试剂的顺序，都要按照方法步骤的要求执行。有时，标准系列虽然不像实际试样那样组成复杂，但仍要求与试样进行同样的处理步骤，以便控制校准曲线上的数据点的空白、回收率等因素。

建立校准曲线时，测量吸光度的参比有两种选择：

第一种种方法用纯溶剂作参比，两个比色皿都放溶剂时，“样品比色皿”的吸光度测定值为比色皿成对性校正值。此后，所有样品吸光度测定值都须扣除此值，进行校正，然后，以纯溶剂为参比，测定空白及标准系列的吸光度，绘制校准曲线。

第二种方法直接用空白为参比，当两个比色皿都放空白时，测定比色皿成对性校正值，然后，测定标准系列的吸光度，绘制校准曲线。

两种方法得到的两条校准曲线互相平行，但*种方法可测定空白的水平，后一种方法不能测定空白，理论上校准曲线通过原点。

若空白为零，两条校准曲线重合。

无论用什么作参比，实样测定时应该使用与建立校准曲线相同的比色皿和同样的参比。比色皿的成对性校正对于使用已久的比色皿有必要，尤其是测量吸光度很小的样品时，校正可保证测量值的可靠性和重复性。

使用校准曲线时应注意：校准曲线包括“标准曲线”和“工作曲线”。应用标准溶液制作校准曲线时，如果分析步骤与样品的分析步骤相比有某些省略时，则制作的校准曲线称为标准曲线。如果模拟被分析物质的成分，并与样品完全相同的分析处理，然后，绘制的校准曲线称为工作曲线。因此，如果基体效应对分析方法至关重要时，应使用含有与实际样品类似基体的标准溶液系列进行校准曲线绘制。