细菌内毒素

医院临床在使用药品注射剂时，常有发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时导致死亡，这种症状称为热原反应。

什么是热原?目前国内外仍未有统一的认识，但从国内外文献报道中，一个共同的意见，都普遍认为：它是指细菌内毒素。欧洲药典委员会副主席J.Van Noordwijk提出：“严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性”。在药品生产质量管理规范(GMP)条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖(Lipoply Saccharide)和微量蛋白(Protein)的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等)及其它微生物(如衣原体、立克次氏体、螺旋体等)的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。

　　菌内毒素化学结构(LPS)

　　细菌内毒素的化学结构

　　细菌内毒素标准品

　　细菌内毒素国家标准品(RSE )： 批号： 981 效价：9000EU

　　细菌内毒素工作标准品(CSE )： 以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价

　　细菌内毒素在水溶液中的状态

　　细菌内毒素很容易吸附在容器壁上或聚集在一起，2005版中国药典明确注明：细菌内毒素标准品溶液要混旋15min并且每稀释一步要混旋30s，以充分混匀。

　　细菌内毒素的耐热特性

　　由于细菌内毒素要在高温250℃ 30分钟才能完全灭活，所以在制药工业和一次性医疗器械及血袋等生产工艺中都是让人头疼的问题，检测使用的各种玻璃器材均应严格清除内毒素后才能使用，我们提供的成品试验器材要经过7道严格工序才达到要求。

　　鲎试剂

　　鲎试剂——从海洋生物鲎的血液提取的生物试剂，只有鲎血与内毒素有特异性的凝胶反应，该试剂达到了国际标准化，全世界均采用该试剂检测细菌内毒素，尚不能采用生物合成的办法制造。其它的检测方法受限与操作过于复杂或成本太高不能普及。

　　细菌内毒素和鲎试剂生化反应原理

　　鲎试剂有两条反应通路，可检测革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素和真菌产生的 1,3-(β,D)-葡聚糖，即可以间接检测革兰氏阴性菌和真菌的存在，目前试剂厂家可以提供分别针对于这两种物质的特异性鲎试剂。

　　鲎试剂的凝胶反应过程观测

　　使用光电检测的原理进行检测反应曲线，即可进行定量检测，目前已经建立了完善的方法学和稳定的检测仪器。

　　检测原理

　　光密度反应时间(t 0.02 )取值方法

　　BET系列仪器检测试管内反应物的光密度OD值，取当OD上升到0.02的点的时间作为反应时间，该点在反应曲线上的位置为浊度开始快速变化的时期，该取值能够快速、稳定的获得反应时间。

　　吸光度限值法反应时间

　　理论分析和大量试验表明，无论以哪种方法确定的反应时间，它都是内毒素含量的标志，内毒素浓度和成胶时间为负相关，即内毒素浓度越高成胶时间就越短。实验证实，临界时间t0.02与内毒素浓度C-t0.02之间也是负相关。通过对标准品进行实验，可得C-关系曲线，对该曲线采用最小二乘法拟合，可以求解出a0、b0的值。在对实验品进行检测时，根据试验品的临界反应时间t0.02和式(2.3-2)，即可求出其内毒素浓度值【1】。

　　反应时间法定量测定原理

　　反应速率测定及浓度计算方法

　　大量试验表明，内毒素浓度越高成胶时间就越快，即反应速度快，将动力学反应曲线变换成微分曲线，即反应速率曲线。

　　反应速率曲线

　　其反应速率最大的点即是反应曲线的拐点，该点的时间作为反应时间就是浊度反应时间法中的t50，最大的反应速率也与内毒素含量相关，通过对标准品进行实验，可得C-Vmax关系曲线，对该曲线采用最小二乘法拟合，可以求解出a0、b0的值。在对试验品进行检测时，根据试验品的最大的反应速率Vmax代入标准曲线方程，即可求出其内毒素浓度值。

　　反应速率法定量测定原理

　　仪器直接鉴别葡聚糖存在的原理

　　由鲎试剂生化反应原理得知，葡聚糖与鲎试剂中的G因子直接反应，然后产生凝胶，而细菌内毒素与鲎试剂的C因子反应，活化C因子再与B因子反应然后产生凝胶，由于反应得进程不同从反应曲线上能够发现明显的区别，内毒素曲线为明显的S型曲线，而葡聚糖曲线为接近直线的斜线，通过反应时间法和反应速率法的共同分析发现，含有葡聚糖的样品检测结果经过两种方法计算数值相差10倍以上，而内毒素的检测结果两种分析方法没有明显区别。