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MPN法应用过程中容易出现的问题-微生物检验员培训考证

    由于对MPN法的理解不充分，很多检测人员在使用MPN法进行微生物定量检测的时候存在很多错误认识，从而极易导致检测结果的错误。在这里对MPN法应用过程中容易出现的问题做一些解释。

1.样品均质和系列稀释必须保证均匀

MPN法样品均质和稀释液混匀非常重要。MPN法的两点假设之一是“微生物在完全混匀的稀释液里随机分布”。混匀不充分，就满足不了MPN法统计的基础，从而不能获得准确的结果。

2.试管各稀释度接种完全

通常，实验室按照3管接种系统来进行MPN检测，即每个稀释度接种3管。然而，往往由于样品中细菌数量比较低，阳性管数很少，很多检测人员为图省事仅接种前2个稀释度。这种做法是十分错误的，仅按照前两个稀释度的结果是没法获得MPN结果的。3个稀释度中，低的稀释度并不一定比高的稀释度阳性管数多。不管前2个稀释度的结果如何， 一个稀释度的结果都是没法预测的。因此，在实际工作中，即便预先估计样品中细菌浓度很低， 9支试管也必须全部接种。

另外，要尽可能多接种几个稀释度，杜绝出现全部稀释度都为阳性的情况，最好能保证结果中包含全阳性或全阴性的稀释度。

3.对接种量和培养基量需要正确理解

接种量是MPN法成功与否的关键，一方面接种量要适当以便于出现全阳性和全阴性的稀释度，另一方面接种量必须准确。MPN表和MPN计算公式都是和接种量密切相关的。而培养基的体积是多少并不重要，只要接种后培养基浓度接近正常浓度(单倍浓度)就可以了。通常接种稀释液的体积是1 mL,这个体积必须准确，而培养基的量是10 mL还是9mL都无所谓。常有人将MPN接种与平板计数稀释混淆，以为必需1 mL稀释液接种到9 mL培养基中。

4.确证后的试管才能计做阳性管

有的MPN法需要多步才能完成可疑菌的确证。只有最终确定为阳性的管才能计数为阳性管。如果没有完成确证步骤，把中间步骤的阳性管计做阳性，就会获得偏高的检测结果。

5.正确理解MPN计数的检测限和精密度

MPN表中最低结果通常表示为“<3/g( mL)"或“<30/100 g(mL)",因此很多检测人员认为MPN法的最高检测限只能达到“3/g(mL)"或“30/ 100 g(mL)" 。

只要调整接种的样品量， MPN法可以检测任何浓度的样品。例如， 3管法按等体积接种双料肉汤，就能将固体样品的检测限提高到“0.3/g"。但是， MPN法是根据概率估计去推算结果，与平板计数直接计数法比起来结果的精密度要差一些。因此，实际工作中MPN法常用于污染水平低的样品的检测，污染水平低的样品靠平板计数等直接计数方法是不易检测的，尤其是对于固体样品污染水平低于10 CFU/g时。

调整接种的样品量还可以采取提高每个稀释度的管数的方法，还能提高MPN法的精密度，获得和平板计数相当(每个稀释度接种10管)甚至更高的精密度(每个稀释度接种10管以上).由于增加每个稀释度的管数导致工作量急剧增加，因此这种做法一般都采用单稀释度接种系统，用来检测低浓度的样品。

6.阳性管数组合检索不到的情况处理

有的检测人员检索MPN表时发现，有的阳性管数组合检索不到，例如，"0-0-3",遇到这种情况不知该如何处理。

在以前的MPN法检测标准里， MPN表中包含所有的阳性管数组合(3管法包括4x4 x4=64组),甚至包括“0-0-3"这样几乎不可能出现的组合。事实上，我们应该对这种结果持高度怀疑态度，应弃用这种结果，重新检测。因此，在新的MPN法检测标准里去掉了这些几乎不可能出现的组合。例如， GB 4789.3-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》仅包括40组阳性管数组合。

7. MPN值需要正确理解

MPN值是基于统计的估计结果， MPN值是可能性最大的一个估计值，其95%置信区间有95%的可能包括真实结果。结果报告的MPN值要结合95%置信限来理解， MPN结果实际上是一个结果分布。

以下面一个例子来理解MPN结果。

【例4-3】 GB 4789.3-2016 中表B. 1接种量0. 1 g、0.01 g和0.001 g对应的阳性管数2、 2、0。产品限值是“<20 MPN/g"。此产品合不合格?

查表得MPN值为“21 MPN/g",其上、下95%置信限分别为“42 MPN/g"和“4.5 MPN/g"。即每克样品中21个大肠菌群，有95%的可能结果分布在每克4.5 (下限)个至42个(上限)之间。换句话说，接种量0.1g、0.01 g和 0.001 g对应的阳性管数2、2、0的100次检测中，有95个结果在每克4.5个至42个之间，其中每克21个的结果次数最多。

绘制图4-9帮助理解。

MPN结果是图4-9中的曲线(以钟形曲线表示),最可能的结果是"4.5"和“42"之间的可能性占95%。平板计数的结果“20"。可以看出，由一半稍多的MPN结果是高于平板计数结果的，另外的MPN结果是低于平板计数结果的。因此，无法判断MPN报告的结果是否高于平板计数的结果。

8.MPN计数结果与平板计数结果孰高孰低

与平板计数法相比，有人说MPN计数偏高，也有人说MPN计数偏低。其实两者的高低并不是绝对的，而是与所用的培养基选择性密切相关。当MPN法的培养基选择性差，更多的非目标菌会被误当作阳性结果，计数容易偏高；当MPN法的培养基选择性高，低浓度的目标菌生长不起来，计数就容易偏低。