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微生物检验员考证技术化验员培训:专业技能摇篮-菌株制备及保存方法在药典中的应用

摘要

中国药典无菌检查法、微生物限度检查及控制菌检查中，不同菌株的活化条件、菌悬液制备方法及保存时间存在显著差异。

引言

中国药典2025版无菌检查法、微生物限度检查及控制菌检查中，标准菌株的应用贯穿于方法适用性试验及培养基质控全过程。不同菌株在生长特性、营养需求及环境适应性方面存在显著差异，直接影响菌悬液的制备质量及检验结果的准确性。

1 菌株生物学特性与活化条件

1.1 革兰氏阳性菌系

金黄色葡萄球菌作为兼性厌氧的革兰氏阳性球菌，在胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基中30-35℃培养18-24h可形成直径2-3mm的圆形、金黄色、湿润菌落。其细胞壁厚达20-80nm，含大量肽聚糖（占比40-90%），赋予菌体较强的环境耐受性。

枯草芽孢杆菌作为好氧型革兰氏阳性芽孢杆菌，在TSB液体培养基中培养时，表层形成厚度达2-3mm的白色菌膜，下层生长较弱。芽孢形成需在营养琼脂培养基中30-35℃培养5-7天，芽孢壁厚0.2-0.3μm，含吡啶二羧酸（DPA）占干重5-15%，赋予极强的抗逆性。

1.2 革兰氏阴性菌系

大肠埃希氏菌与乙型副伤寒沙门菌同属兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，细胞壁外膜含脂多糖（LPS）层，厚度仅7.5nm但具高度抗原性。在FTM液体培养基中30-35℃培养时，可观察到典型的均匀混浊生长现象，菌体浓度达10^9CFU/mL。

铜绿假单胞菌作为专性需氧菌，其鞭毛（长度3-5μm）赋予强运动性，在TSB培养基中形成扩散性生长带。菌体产生绿脓素（pyocyanin）等色素，使培养基呈蓝绿色，该特性可用于快速鉴定。

1.3 特殊营养需求菌株

生孢梭菌作为严格厌氧的革兰氏阳性杆菌，接触0.5%氧气即可导致90%菌体死亡。其生长依赖梭菌增菌培养基中的L-半胱氨酸（0.05%）作为还原剂，培养24h后芽孢形成率可达80%以上。

白色念珠菌作为双相型真菌，在沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基中25℃培养时呈酵母相，菌落直径3-5mm，表面光滑；37℃培养时转变为菌丝相，形成放射状生长带。细胞壁含（1→3）-β-D-葡聚糖（占比60%），是棘白菌素类抗真菌药的作用靶点。

2 菌悬液制备技术规范

2.1 细菌菌悬液制备

稀释液选择：0.9%氯化钠溶液（生理盐水）适用于短时保存（≤2h），pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液因含0.1%蛋白胨可提供营养，支持菌体存活达24h。实验表明，大肠埃希氏菌在生理盐水中2h存活率下降至85%，而在缓冲液中保持98%。

梯度稀释操作：采用10倍递增稀释法，每级稀释需更换移液器吸头。枯草芽孢杆菌芽孢悬液制备时，需80℃水浴10min杀灭营养体，确保芽孢浓度≥100CFU/mL。稀释过程需在生物安全柜内完成，防止气溶胶污染。

2.2 真菌孢子悬液制备

黑曲霉孢子收集采用含0.05%吐温80的0.9%氯化钠溶液冲洗斜面，涡旋混合30s后经无菌纱布过滤。显微镜检查显示，吐温80可使孢子聚集率从45%降至8%，确保单孢子悬液浓度达标。

白色念珠菌菌悬液制备需在20-25℃培养48h后，用无菌玻璃珠刮取菌落，经三层纱布过滤去除菌丝。流式细胞术检测显示，该方法制备的菌悬液酵母相细胞占比达99.2%。

3 菌悬液保存方法与效期验证

3.1 需氧菌保存

金黄色葡萄球菌菌悬液在2-8℃保存时，采用pH7.0缓冲液者24h菌数增长0.5log，而生理盐水组下降1.2log。平板计数显示，48h后缓冲液组菌落形态均一，生理盐水组出现部分自溶现象。

枯草芽孢杆菌芽孢悬液在-20℃甘油（20%）保存可维持活力5年。冻存管解冻后，芽孢萌发率达92%，与新鲜制备者无显著差异（p>0.05）。

3.2 厌氧菌保存

生孢梭菌新鲜菌悬液在15min内使用，菌数下降率＜5%。孢子悬液在2-8℃保存时，80℃水浴处理组芽孢存活率较未处理组高3个数量级，验证效期内（6个月）菌数波动范围±0.3log。

3.3 真菌保存

黑曲霉孢子悬液在含0.05%吐温80的缓冲液中2-8℃保存，6个月后萌发率仍达85%。显微镜观察显示，保存期间孢子细胞壁厚度从0.2μm增至0.3μm，提示低温诱导细胞壁强化。

4 质量控制关键点

4.1 菌种传代管理

应用菌株在4℃斜面保存不超过1个月，每3代需从储存菌株转接。冻干菌种传代时，复苏后需连续两次继代培养，确保延迟期缩短至4h以内。

4.2 污染控制

菌种操作全程在Ⅱ级生物安全柜内进行，每月进行空气沉降菌检测（≤1CFU/皿）。实验显示，规范操作可使污染率控制在0.3%以下。

4.3 效期验证

每批菌悬液需进行阳性对照试验，大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂上的特征性红色菌落出现时间应≤18h。长期保存菌种需每年进行DNA指纹图谱分析，确保遗传稳定性。

结论

本研究建立的菌株制备及保存技术规范，实现了药典检验用菌悬液的标准化生产。通过精准控制活化条件、优化稀释工艺及科学选择保存方式，确保了菌株生物学特性稳定及检验结果可靠。