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出口食品生产企业卫生细菌检验方法

    一 食品接触面（包括工作台、工器具操作者的手和内包装物料等）细菌污染情况的检验

检验项目：细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌

A、细菌总数的测定

1、培养基制备

（1）营养琼脂培养基

     蛋白胨         10.0g

     牛肉膏         10.0g

     氯化钠          5.0g

     琼脂            15g

     蒸馏水       1000ml

将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装试管或烧瓶，121℃高压灭菌15min，最终ph7.4-7.6

（2）生理盐水

     氯化钠          8.5g

     蒸馏水        1000ml

     搅拌均匀装瓶或试管，121℃高压灭菌30min

2、操作步骤

（1）取样

在食品接触面上（冬季取2500px2，夏季取1250px2）用无菌镊子夹取无菌棉球沾无菌蒸馏水揩拭，然后放入无菌生理盐水中（10ml）充分振摇，制成原液（1：10）

操作者的手

用无菌镊子夹取无菌棉球揩拭操作者任何一只手的掌面后将棉球放入10ml灭菌生理盐水中，充分振摇均与制成原液（1:10）

（2）用1ml的灭菌吸管分别吸取1:10的原液1ml注入含有qml灭菌生理盐水的试管内，制成1:100的稀释液，按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次换一支1ml灭菌吸管。

（3）选择2-3个适宜的稀释度即取1ml稀释液注入灭菌的培养皿中，每个稀释度的样液用两个平皿（作好适宜标志）倒入凉至45℃的培养基12-15ml，立即将平皿内的样液和琼脂培养基充分混合，混合方法是将平皿倾泻和旋转。

（4）培养

     待琼脂凝固后将平皿翻转，立即放进36±1℃的恒温箱内培养24h计数。

（5）结果报告

 报告每cm2食品接触面（操作台工器具）中的平板菌落数。

 或没一只手面的平板菌落数。

B大肠菌群

1、培养基制备

          蛋白胨           10g

          磷酸氢二钾        2g  

          去氧胆酸钠        1g

          中性红          0.04125g

          乳糖             10g

          柠檬酸铁铵        2g

           琼脂               12-14g

           蒸馏水             1000ml     

      蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾加入蒸馏水，加热溶解，并用10%碳酸钠溶液（应调ph7.3-7.5），加琼脂溶化，再加柠檬酸铁铵，去氧胆酸钠溶解后，被充消耗水分，用250ml三角瓶，每瓶分装100ml高压灭菌112℃20min，临用前以无菌操作向每瓶（100ml培养基）中加0.33%中性红水溶液1.25ml,20%无菌乳糖溶液（已1120c20分钟灭菌）5ml。

    2、检验方法

    （1）取样：

 在100或1250px2的工器具面积上（冬季取2500px2，夏季取1250px2）用无菌镊子夹取无菌棉球沾无菌蒸馏水揩拭，然后放入无菌生理盐水中（10ml）充分振摇，制成原液（1：10）

操作者的手的取样

方法同工器具的检验，用灭菌的棉签揩拭手掌面（手背面不取）将棉签放入已准备好的灭菌生理盐水中（10ml），振荡摇匀。

（2）接种与培养

    用无菌吸管分别吸取上述原液1ml注入灭菌平皿中，作两个平皿，倒入冷至45℃左右的培养基约15ml。摇匀凝固后再在上层倒入3-5ml培养基旋转平皿，覆盖于表面37℃培养18h，控制菌落密度在每个平皿10个左右阳性率最正确，如果菌落密度大可以将原液稀释10倍100倍等。

   （3）结果出报告

平板上出现的大肠菌群呈深红色，菌落直径大于0.5mm，周围可能有雾状胆盐沉淀，菌落形态有的边缘整齐，呈圆形，扁平，有的边缘不齐，表面凸起或呈波状，且为玫瑰红色，这时检验即为阳性，每平方厘米大肠菌群=测得菌落数×稀释度/取样面积，每1平方厘米上的大肠菌群数不到一个的，可化为每平方米上的个数，操作者手一只手掌面的大肠菌群个数为报告结果。

C金黄色葡萄球菌

1、培养基

   （1）生理盐水    氯化钠         8.5g

                    蒸馏水       1000ml

搅拌均匀装瓶或试管以121℃高压灭菌30min。

   （3）B-P培养基（配制方法同“出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法”）

   （4）兔血浆

2、检验方法

   （1）取样：在100或1250px2的工器具或工作台面积上用消毒棉签（稍微湿一些）揩拭，然后放入10ml灭菌含生理盐水中充分振摇制成原液。

   （2）接种与培养

将上述制成的原液取1ml放入灭菌平皿后，倾注15-20ml的B-P培养基，36±1℃培养46±2h。

或是吸取0.1ml，用L棒涂布于表面干燥的B-P琼脂平板，36±1℃培养46±2h。

从每个平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌的菌落作为血浆凝固酶试验。

（3）报告结果

     定性报告

     如B-P琼脂平板的可疑菌落作凝固酶试验为阳性，即报告100或1250px2工具器上有金黄色葡萄球菌存在。

二 原料、半成品卫生细菌检验

检验项目：细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、芽孢数、平酸菌

（一）罐头检测细菌总数、大肠菌群、芽孢数、必要时加测金葡菌和平酸菌检验。

     1、细菌总数的测定：

    （1）培养基：营养琼脂

           蛋白胨     10g         琼脂10-20g

           牛肉膏     10g         蒸馏水1000ml

           氯化钠      5g         ph7.4-7.6          121℃灭菌20min

     （2）操作方法：

     以无菌操作，取25g样品，放入盛有225ml灭菌生理盐水瓶内，充分振摇作成1:10的均匀稀释液。

      用1ml灭菌吸管，吸取1:10的稀释液1ml注入含有9ml灭菌生理盐水管内作成1:100的稀释液。

      按上述操作顺序作10倍递增稀释液，每稀释一次换用一支1ml灭菌吸管。

      选择2-3个适宜的稀释度，即吸取1ml放入灭菌的平皿中，每个稀释度作2个平皿，倒入凉至45℃的琼脂摇匀，凝固后，翻转倒置36±1℃培养24h计数。

      报告：每克样品中的杂菌数（乘以稀释倍数）。

      2、大肠菌群的测定

     （1）培养基：同前面工具的培养基。

     （2）检验方法：无菌称取25g样品，加225ml灭菌生理盐水作10倍递增稀释。

     （3）每个稀释度作两个平皿，倒入培养基，凝固后将平皿翻转，放入36±1℃培养后计数。

     （4）结果报告：每克样品中大肠菌群的个数。

       3、金黄色葡萄球菌的测定

     （1）培养基：生理盐水   B=P培养基

     （2）检验方法：无菌称取样品25g加225ml灭菌生理盐水制成1:10的样品匀液。

      吸取0.2ml放入两个B-P平板各0.1ml，用L棒涂布均匀，36±1℃培养48h。挑取可疑菌落，作血浆凝固酶试验。

      用MPN法进行检验

     （3）结果报告：

      每克样品金葡菌阳性或是每克样品中的个数。

      4、芽孢数的测定

      培养基：

        牛肉膏        10g

        氯化钠         5g

        蛋白胨        10g

        K2HPO4        3g

        MnSO4      0.03g

        琼脂25g，黄豆浸液1000ml，ph7.2-7.4,121℃灭菌15min。

      营养琼脂培养基（但要以黄豆浸汁代替蒸馏水配制，如要鉴别是否为平酸菌，可加1.6%溴甲酚紫2ml/1000ml）。

      操作方法：无菌操作取半成品50g，盛装于已灭菌的三角瓶中，加无菌蒸馏水50ml,煮沸15分钟快速冷却，用无菌吸管分别吸取1ml注入二个平皿中，倒入凉至45℃左右的培养基约15ml，摇匀置37℃温箱中培养48h，直接计数。

3、报告：二只平皿的平均菌落数就是每克半成品中所含的芽孢数。

黄豆浸出液的制法：黄豆粉或黄豆100g，水1200ml，置水溶液中100℃1h取出冷却后，置冰箱内过夜，第二天过滤补足无菌水至1000ml，再加K2HPO4 0.5g备用。

（二）其他产品检测方法同成品

     三 空气中杂菌数的测定（沉降法）

     1、培养基：普通营养琼脂

     2、操作方法：将培养基冷至45℃，倾注入平皿，每皿约15ml，36℃灭菌24h，检查无杂菌生长，取无菌的平皿，在车间的前后，左右，中就个点放置一个平皿，并打开盖暴露5分钟即放在36±1℃培养24h，计算菌落数。

     3、计算：每立方米细菌数=50000N/AT

     式中：A-所用平皿面积（cm2）

           T-平皿暴露于空气中的时间（分）

           N-培养后，平皿上的菌落数